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篇1

關(guān)鍵詞：硒蛋白P：基因多態(tài)性：遺傳易感性：腫瘤

中圖分類號：Q51； Q71；R394.3

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2014）05-0441-04

硒蛋白家族共有25種蛋白，而Seppl是硒蛋門家族中非常重要的成員之一，最初在小鼠血漿中發(fā)現(xiàn)，占血漿總硒含量的60%，主要由肝臟合成分泌入血，在轉(zhuǎn)運硒到非肝臟組織的同時還具有抗氧化酶的活性，在保護機體免受氧化損傷、運輸硒到非肝臟組織、維持血漿硒含量穩(wěn)定等方面具有重要作用?；蚯贸鞍譖的小鼠中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細胞退化導致癲癇和共濟失調(diào)、非肝臟組織硒蛋白表達量降低和雄性小鼠不育。其基兇變異將影響功能發(fā)揮，抗氧化能力和轉(zhuǎn)運硒原子的能力降低，進而影響其它硒蛋白的合成，機體整體的抗氧化能力將會降低，而許多研究也表明，Seppl基因多態(tài)性與Seppl的存在形式、功能的發(fā)揮及與疾病的患病風險密切相關(guān)，近年來發(fā)現(xiàn)，Seppl在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。1

硒蛋白P1.1 硒蛋白P的基因結(jié)構(gòu)

人類硒蛋白P基因（Seppl）位于染色體基因組5q31，全長12 kb，由5個外顯子組成，起始密碼子ATG和編碼第一個硒代半胱氨酸的TGA位于第2個外顯子上，第5外顯子長1 400 bp，含有9個編碼硒代半胱氨酸的TGA。Seppl的mRNA的3’非編碼區(qū)（3’UTR）含有兩個硒代半胱氨酸插入序列（SECIS）元件，并具有不同的生物學應(yīng).SECIS 1指導UCA解碼為硒代半胱氨酸（Sec）的效率足SECIS 2的3倍，但僅指導C端片段上的9個Sec的摻入，基因敲出SECIS1后發(fā)現(xiàn)Seppl的產(chǎn)物終止于第一個或者第二個Sec，SE-CIS2指導第一個Sec的摻入，可能為后續(xù)硒代半胱氨酸的插入做準備工作。

1.2 硒蛋白P的結(jié)構(gòu)

Sepp1含有兩個結(jié)構(gòu)域，為雙功能蛋白，由兩個大小小同的片段構(gòu)成，大片段含有244個氨基酸殘基，僅含的一個Sec殘基位于UxxC，氧化還原模體中（U為硒代半胱氨酸，x為任意氨基酸，C為半胱氨酸），具有抗氧化酶的活性；小片段含有122個氨基酸殘基，從第245位殘基到C-末端，含有9個硒代半胱氨酸殘基，具有運送硒供外周組織利用的功能。此外發(fā)現(xiàn)，人血漿中含有兩種形式的Seppl.分別為51 kD和61 kD。

1.3 硒蛋白P的生理功能

l.3.1 轉(zhuǎn)運和儲存硒

Motsenbocker根據(jù)大鼠注射75Se的亞硒酸鹽及75Se標記的Seppl后75Se的分布情況推測，Seppl在肝臟合成并將硒轉(zhuǎn)運到非肝臟組織中。隨后基因敲除Seppl的小鼠模型的建立確認了Seppl具有轉(zhuǎn)運硒的功能。在基因敲除Seppl的小鼠模型中尿硒含量增加，隨之血硒含量降低，說明硒蛋白P在硒代謝中具有重要作用。

1.3.2

抗氧化

Saito等從人血漿里分離出Seppl后發(fā)現(xiàn)Seppl可以清除磷脂氫過氧化物從而確定Seppl具有抗氧化酶的活性，在保護機體免受氧化損傷中起著重要的作用。Xiao等發(fā)現(xiàn)在人類角質(zhì)細胞中Seppl具有抵抗4-CIBQ誘導的氧化損傷作用。Eckers等研究發(fā)現(xiàn)，Seppl可以保護細胞免受輻射誘導產(chǎn)生的活性氧對細胞的損傷作用。

1.3.3 參與的成熟和發(fā)育

存硒缺乏時是繼大腦之后的第二個優(yōu)先利用硒的器官.基因敲除Sepp1的雄性小鼠不能產(chǎn)生正常的和不育，Sepp1（一/一）的雄性成熟的小鼠將產(chǎn)生鞭毛結(jié)構(gòu)缺陷的。此外，Seppl對于組織中硒含量的穩(wěn)定非常重要，Seppl運輸硒到供其它硒蛋白的合成，如谷胱甘肽磷脂過氧化物酶（PHGSH-Px），PHGSH -Px是成熟的主要蛋白，參與構(gòu)成線粒體內(nèi)膜和保護免受氧化損傷。

1.4 硒蛋白P的生理代謝

Seppl主要由肝臟合成，腎臟和心臟也合成少量的Seppl，然后分泌入血，占血漿中總礬含量60%（大鼠）或40%（人），進入外周組織后C端片段分泌硒被組織細胞攝取，此外，大腦和具有優(yōu)先利用Seppl的特權(quán)，通過載脂蛋白E受體2 （apoiipoprotein receplor 2，ApoER2）被大腦和組織細胞攝取利用.大腦在利用Seppl提供的硒重新合成Seppl并分泌到腦脊液中，具有火腦硒儲存池的作用，在腎臟通過lipoprotein megalin receptor （Lrp2）攝取原尿中Sepp1分泌的硒，進而調(diào)節(jié)機體硒含量，N端片段與細胞膜具有較強的親和力，釋放了硒的SeppI結(jié)合到細胞膜上發(fā)揮抗氧化的作用。

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硒蛋白P基因多態(tài)性

人類Seppl基岡單核苷酸多態(tài)性位點現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10 000多個，研究發(fā)現(xiàn)這些多態(tài)性位點有些與硒蛋白P的存在形式、功能的發(fā)揮及與疾病的患病風險密切相關(guān)，其中 rs3877899和rs7579位點研究的最多。這兩個多態(tài)性位點分布頻率在高加索人、中國人及南亞人群中基本相同，AA基因型均是低頻基因型。rs3877899多態(tài)性位點位于編碼區(qū)，導致Sepp1第234位氨基酸由丙氨酸（Ala）變?yōu)樘K氨酸（Thr），也許影響Seppl的翻譯后修飾.進而影響其含量；rs7579位于3'UTR，25191位點，該位點的基因變異可以影響Sepp1合成過程中硒代半胱氨酸的插入。研究發(fā)現(xiàn)Seppl rs3877899多態(tài)性位點和rs7579多態(tài)性位點與Seppl的存在形式相關(guān)，Meplan等研究發(fā)現(xiàn)Seppl rs3877899多態(tài)性位點，Seppl 61 kD型在GC基因型中比在GA基因型中多；rs7579多態(tài)性位點.GG基因型比GA和AA基因型的61 kD形式硒蛋白含量低。Penney等研究發(fā)現(xiàn)在前列腺癌患者腫瘤組織中，Sepp1的mRNA水平與rs230820相關(guān)，AA純合子比CC純合子的mRNA量高3.6%。

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硒蛋白P基因多態(tài)性與腫瘤

3.1

硒蛋白P基因多態(tài)性與乳腺癌

乳腺癌是女性患病率最高的腫瘤，嚴重威脅女性健康，而Seppl的基因多態(tài)性被認為與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)。Meplan等以丹麥975例乳腺癌患者和975例對照組作為研究對象進行Seppl基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感性關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Seppl rs3877899多態(tài)性位點AA純合子的乳腺癌的發(fā)病率更低，進一步研究發(fā)現(xiàn)，rs3877899位點僅與導管性乳腺癌的遺傳易感性相關(guān)，與非導管性乳腺癌不相關(guān)；rs7579位點與乳腺癌的遺傳易感性不相關(guān)。

3.2 硒蛋白P基因多態(tài)性與前列腺癌

對于前列腺癌，Seppl基因多態(tài)性與其遺傳易感性研究結(jié)果缺乏一致性，Steinbrecher等發(fā)現(xiàn)在歐洲人群中Seppl rs7579多態(tài)性位點AA純合子相比于GG純合子前列腺癌的發(fā)病風險的OR值為1.72，rs3877899位點與前列腺癌的患病風險小具有相關(guān)性。Penney等對美國1 352例前列腺癌患者和l382例對照者進行SNP分型分析發(fā)現(xiàn)，Seppl rsl1959466位點T等位基因可以升高前列腺癌的患病風險（OR值為1.31；95%可信區(qū)間為1.02～1.69；P值為0.03），rs13168440多態(tài)性位點CC基因刑具有更低的患病風險（OR=0.56， 95%可信區(qū)間為0.33―0.96），rs12517112位點和rs230820位點與前列腺癌的患病風險不具有相關(guān)行，這4個SNP位點與前列腺癌的預后不具有相關(guān)性。Gevbels等對1 309例歐洲前列腺癰患者和l266例對照進行Seppl的6個SNP位點進行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)在有局部或遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中，rs3797310和rs3877899多態(tài)性位點與前列腺癌的遺傳易感性相關(guān)，在未轉(zhuǎn)移的前列腺痛中不具有相關(guān)性，在有局部或遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中，rs3797310多態(tài)性位點TT等位基因是CC等位基因患前列腺癌的1.68倍，rS3877899多態(tài)性位點AA等位基因是GG等位基因患前列腺癌的0.33倍，但經(jīng)過多因素logistic：回歸分析，校正了體重指數(shù)（BMl）、患病年齡等影響因素后發(fā)現(xiàn)rs3797310和rs3877899多態(tài)性位點與前列腺癌的遺傳易感性不具有相關(guān)性。rs7579多態(tài)性位點等其他4個多態(tài)性位點不與前列腺癌的發(fā)病風險相關(guān)， Geybels等分析的這6個Seppl多態(tài)性位點與前列腺癌的預后亦無相關(guān)性。

3.3 硒蛋白P基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌

Meplan等發(fā)現(xiàn)在捷克共和國人群中，Sepplrs7579 AA純合子相比于GG純合子結(jié)直腸癌的發(fā)病風險的OR值為1.67，但rs3877899、rs12055266、rs3797310和rs2972994多態(tài)性位點與結(jié)直腸癌不具有相關(guān)性。Peters等收集772例晚期左側(cè)結(jié)直腸腺癌和777例對照者的標本，發(fā)現(xiàn)在Sepplrs2972994多態(tài)性位點TT純合子相比于CC純合子，可以降低晚期左側(cè)結(jié)直腸腺癌的發(fā)病風險.其OR值為0.85 （95% CI 0.63―1.15）； rs3797310位點AA純合子相比于GG純合子可以升高晚期左側(cè)結(jié)直腸腺癌的發(fā)病風險，其OR值為l.53（95% CI 1.05―2.12）； rs12055266位點GG 純合子相比于AA純合子，可以升高晚期左側(cè)結(jié)直腸腺癌的發(fā)病風險，其OR值為1.48（95% CI 1.00～2.19）； rs3877899位點和rs6413428位點與晚期左側(cè)結(jié)直腸腺癌的發(fā)病風險不具有相關(guān)性。

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硒蛋白P基困多態(tài)性與慢性腎病

Hishida等收集了568例日本慢性腎病患者和2 717例對照者，進行Seppl rs7579、rs12055266、rs3797310和rs2972994位點多態(tài)性與慢性腎病的遺傳易感性的關(guān)聯(lián)性研究，發(fā)現(xiàn)這些多態(tài)性位點不會影響慢性腎病的發(fā)病風險。

5

硒蛋白P基因多態(tài)性與大骨節(jié)病

大骨節(jié)?。╧ashin-beck disease，KBD）主要分布于我國北部山區(qū)、西伯利亞爾部和朝鮮北部，因在我國本病病區(qū)分布與低硒十壤地帶大體上一致，病人體內(nèi)可查出與低硒相聯(lián)系的一系列代謝變化，病區(qū)人群頭發(fā)硒水平上升時，病情下降，補硒后能降低大骨節(jié)病的新發(fā)率等間接證據(jù)，懷疑大骨節(jié)病與缺硒有關(guān)，而Seppl在體內(nèi)運輸硒到各個組織中起著重要作用，Seppl基因變異可能影響大骨節(jié)病的患病風險，但Xiong等和Sun等分別研究發(fā)現(xiàn)在中國人群中rs7579位點與大骨節(jié)病（KBD）患病風險不具有相關(guān)性。

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硒蛋白P的基因變異與其他硒蛋白的相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，Seppl可以與其他礬蛋白和疾病影響因素一起影響疾病的發(fā)生發(fā)展，Cooper等研究發(fā)現(xiàn)男性人群中SOD2 Val （16）Ala多態(tài)性與前列腺癌的患病風險相關(guān)，Ala純合子可以升高前列腺的發(fā)病風險，OR值為1.19，但Seppl rs3877899位點GG基因型聯(lián)合SOD2-Ala16+純合子可以進一步升高前列腺癌的發(fā)病風險，OR值為1.43；男性吸煙人群中，SOD2-Ala16+純合子并Seppl rs3877899多態(tài)性位點GG基因型聯(lián)合吸煙導致前列腺癌發(fā)病風險更高，OR值為1.97。Penney等研究發(fā)現(xiàn)吸煙聯(lián)合rsl1959466位點T等位基因，肥胖聯(lián)合rs13168440位點TT基因型可以進一步升高前列腺癌的死亡率。說明硒蛋白基因變異具有累加效應(yīng)，在吸煙或者肥胖患者中，機體產(chǎn)生更多的活性氧，而有些基因型可以更高效地清除氫過氧化物，而凸顯優(yōu)勢基因型的優(yōu)勢，優(yōu)勢比進一步擴大。

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篇2

Klotho基因是Kuro等〔1〕于1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因，并用古希臘神話中紡織生命之線女神的名字命名。Klotho基因被敲除的小鼠(KL-/小鼠)可出現(xiàn)類似人類衰老的各種表型，如壽命縮短、不育癥、動脈硬化、皮膚萎縮、骨質(zhì)疏松、肺氣腫等。近年來對klotho基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系逐漸受到重視，現(xiàn)將有關(guān)研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 Klotho基因的結(jié)構(gòu)

Klotho基因長50 kb，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成〔2，3〕。人的klotho基因位于13q12，klotho基因的操縱子內(nèi)沒有TATA盒和CAAT盒，但有5個潛在的SP1結(jié)合位點，外顯子1及旁側(cè)2 000 bp序列中，G+C的平均含量為66.75%，最高達到98%，提示在這一區(qū)域有CpG島的存在〔1，4〕。在klotho基因結(jié)構(gòu)中，其RNA存在著一個潛在的可變剪切位點，這一位點如果接受了一個50 bp片段的插入，該插入序列末尾的兩個核苷酸TA就會與外顯子4的第一個核苷酸G共同構(gòu)成一個終止密碼TAG，使得RNA由此截斷形成一個短的開放閱讀框，僅含3個外顯子和2個內(nèi)含子而編碼分泌型klotho蛋白。但如果可變剪切位點沒有50 bp片段的插入，其RNA就是一個完整的結(jié)構(gòu)，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，編碼形成一種膜型klotho蛋白。人的膜型klotho cDNA全長3 036 bp，分泌型cDNA全長1 647 bp。膜型klotho基因表達的膜型蛋白是一種單跨膜蛋白，包括一個N端信號序列、帶有兩個內(nèi)部重復片段的KL1和KL2細胞外區(qū)域，一個單跨膜區(qū)和一個短的胞內(nèi)區(qū)。在KL1和KL2之間有一段LysLysArgLys的堿性氨基酸序列，可能為蛋白酶裂解位點，該位點有時可能被裂解，釋放出小肽而作為體液因子發(fā)揮作用。而分泌型klotho基因表達的分泌型蛋白由于可變剪切的原因，僅含有N端序列和KL1胞外區(qū)，缺少了KL2胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。人的膜型蛋白含有1 012個氨基酸，分泌型蛋白含有549個氨基酸。

2 Klotho基因多態(tài)性

Klotho 基因共含有400多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，其中影響轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的主要是啟動子區(qū)和外顯子區(qū)的SNPs，其中啟動子區(qū)有 16個SNPs，5個外顯子區(qū)共有15個SNPs，其余均在內(nèi)含子內(nèi)。目前研究最多的是KLVS〔5〕，包含6個SNPs，位于外顯子2區(qū)附近，3個SNPs在外顯子2區(qū)內(nèi)，其中1個為無義突變，另兩個F352V（A1056G） 和C370S（G1110C），這6個SNPs處于完全連鎖不平衡。KLVS具有明顯的種族特異性，白種人群有 20%～31%的變異〔5，6〕，而日本和韓國等亞洲人群未發(fā)現(xiàn)變異〔7，8〕。其他如啟動子395也存在GA變異，在正常人群中G、A的頻率分別為80.4%～85.7%和14.3%～19.6% 〔7，9，10〕。該等位基因是Kawano等〔8〕在研究絕經(jīng)后婦女骨密度時發(fā)現(xiàn)，電泳遷移率變動分析(EMSA)顯示GA替換后DNA蛋白復合物的量明顯下降，推測該替換可能通過減少蛋白和klotho基因啟動子區(qū)結(jié)合而改變klotho基因表達。外顯子4區(qū)的C1818T（HisHis）的變異，并不能引起氨基酸表達的改變，但可能也與某些疾病有關(guān)，多項研究表明〔11，12〕外顯子區(qū)的無義突變也可能產(chǎn)生有異常功能的多種轉(zhuǎn)錄或影響產(chǎn)物的表達水平，Kawano等〔8〕用RTPCR方法沒有發(fā)現(xiàn)C1818T變異引起的klotho基因轉(zhuǎn)錄的變化，推測C1818T位點可能與影響klotho基因功能的一個SNP位點有機聯(lián)系在一起。在正常人群中C、T的頻率分別為58.9%～81.9%和18.1%～41.1%〔7，10〕。klotho基因其他SNPs如啟動子區(qū)G959C 、外顯子1區(qū)A44C和C234G、外顯子4區(qū)C2298T等，因未發(fā)現(xiàn)與疾病有關(guān)或小等位基因頻率低于5%，在此不再贅述。

3 Klotho基因多態(tài)性與疾病易感性的關(guān)系

3.1 Klotho基因與心血管疾病

Klotho基因缺陷的小鼠在出生4 w后即可出現(xiàn)動脈硬化，并隨著年齡的增加而加重，這些血管變化與人類動脈硬化非常相似。把外源性正常klotho cDNA轉(zhuǎn)導給klotho基因缺陷的小鼠后，其動脈硬化程度可得到顯著改善〔1〕，由此推測在人體也可能存在klotho基因突變或有特定的klotho等位基因與動脈硬化密切相關(guān)。為此，Arking等〔13〕檢測了兩組相互獨立的無癥狀冠心病患者的KLVS等位基因頻率，同時比較冠心病的危險因素如血糖、血脂、血壓、體重指數(shù)、吸煙情況，經(jīng)過Logistic回歸分析，證實KLVS等位基因是早發(fā)冠心病的獨立危險因素。隨后他們〔14〕又檢測了525例北歐猶太教徒的KLVS等位基因頻率，并用多元回歸法分析KLVS基因型與血壓、血脂等心血管危險因素的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HDLC和收縮壓與KLVS具有相關(guān)性，野生型（FF）和KLVS純合型（VV）與雜合型（FV）相比，HDLC分別下降了3.47和9.80 mg/dl，收縮壓升高6.51和 18.97 mmHg，提示KLVS純合型患心血管疾病的危險度最高。用Cox回歸分析，KLVS純合型和野生型較雜合型相對危險度提高了4.49和2.15倍。以上報道均提示KLVS基因與心血管疾病密切相關(guān)。除KLVS基因外，在亞洲地區(qū)也進行了啟動子區(qū)G395A與心血管疾病關(guān)系的研究其關(guān)系目前尚不明確。Imamura等〔9〕認為冠狀動脈狹窄患者klotho基因395A等位基因頻率(29.9%)明顯高于對照組(19%)，調(diào)整后的P=0.029，而冠狀動脈痙攣組(23.4%)與對照組無顯著性差異，從而推測395A可能是冠心病獨立的基因危險因子。而Rhee等〔15〕在對274例因胸痛進行冠狀動脈造影檢查的韓國人G395A分型中發(fā)現(xiàn)，冠心病患者攜帶A等位基因(GA+AA)的頻率(45.1%)與非冠心病患者(54.9%)相比，兩者無顯著差異(P=0.746)，目前395A等位基因是否是冠心病篩選基因還有待大樣本進一步證實。

3.2 Klotho基因與骨質(zhì)疏松

人的骨質(zhì)密度是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，實際上Ralston等〔16〕認為基因在骨質(zhì)密度方面可能起到50%～80%的作用，而且不同基因在不同年齡階段起著不同作用。由于KL-/-小鼠可出現(xiàn)類似人類衰老的各種表型，包括骨質(zhì)疏松，由此推測klotho基因多態(tài)可能與骨質(zhì)疏松有關(guān)。Kawano等〔8〕研究報道在55例≥65歲絕經(jīng)期婦女的小樣中提示klotho基因可能與衰老有關(guān)的骨質(zhì)疏松有關(guān)。Mullin等〔17〕報道與此相反，他們檢測1 190例白種人絕經(jīng)期婦女基因型及其各部位（包括髖骨、股骨頸、股骨粗隆和粗隆間）的BMD和其中200例降鈣素，發(fā)現(xiàn)G395A和C1818T兩基因多態(tài)與各部位的BMD無關(guān)，而C1818T多態(tài)與血清降鈣素有關(guān)，TT型的降鈣素明顯大于CT型，CT型大于TT型。以上報道存在矛盾之處，提示G395A和C1818T多態(tài)與人體骨質(zhì)密度(BMD)可能無關(guān)，還有待進一步研究。在T352V與BMD的關(guān)系方面，Zarrabeitia等〔18〕檢測362位西班牙男性的F352V基因型和各部位(包括腰椎、股骨頸、髖骨和跟骨)的BMD，362位男性作為整體，F(xiàn)V+VV基因型的BMD與FF的無明顯區(qū)別，≤53歲的中青年人群中，F(xiàn)V+VV基因型的BMD明顯高于FF基因型的。Riancho等〔10〕則認為女性的F352V基因型和BMD的關(guān)系與絕經(jīng)狀態(tài)有關(guān)，絕經(jīng)前F352V基因型和BMD無關(guān)，絕經(jīng)后含F(xiàn)V+VV基因型的婦女BMD較含F(xiàn)F基因型的高。由此推測F352V多態(tài)與BMD可能有一定的關(guān)系。FF基因型可能是骨質(zhì)疏松的危險因素。

3.3 Klotho基因與糖代謝

由于KL-/小鼠血糖和胰島素水平下降且胰島素敏感性增加，相反，klotho過表達的小鼠胰島素抵抗，推測klotho基因可能與糖尿病有關(guān)。Rhee等〔19〕檢測251例健康韓國婦女快速血糖和胰島素抵抗指數(shù)（HOMAIR）并用RTPCR檢測klotho基因型，發(fā)現(xiàn)G395A與血糖無關(guān)，而C1818T與血糖有關(guān)，含T等位基因血糖高于C等位基因，HOMAIR 平均值也明顯增高，提示klotho基因可能是研究糖代謝的候選基因之一。Graham等〔20〕在對1 793例無糖尿病家族史的2型糖尿病患者、1 619例正常對照和來自509例2型糖尿病家庭的1 616例個體進行klotho基因F352V檢測，證明糖尿病患者FV+VV基因型（28%）與正常對照（28%）無顯著差異，用FBAT軟件進行家系關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)V等位基因與糖尿病并無明顯關(guān)聯(lián)，提示在大型病例對照研究和家系研究中并未發(fā)現(xiàn)klotho基因F352V與2型糖尿病有關(guān)。

3.4 Klotho基因與腫瘤

Klotho的功能目前研究較多的是：①klotho蛋白抑制氧化應(yīng)激、提高哺乳動物細胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力〔21〕；②抑制參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的IGF1R的作用〔22～25〕；③klotho基因缺乏的小鼠具有免疫抑制作用〔1，26〕。以上均提示klotho可能是一個腫瘤抑制因子〔27〕。Wolf等〔28〕在研究klotho蛋白的表達與肺癌的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)klotho表達在正常肺組織較肺癌組織高，在癌組織中，癌塊較小的肺癌組織klotho表達較較大的肺癌組織高，Wolf等的結(jié)論證實klotho可能是一個腫瘤抑制因子。然而 Lingeng 等〔29〕在研究卵巢癌與klotho蛋白表達的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)卵巢上皮細胞癌組織klotho蛋白表達較正常組織增高，klotho表達可能與卵巢癌的進展有關(guān)，這一結(jié)論與Wolf等結(jié)果相矛盾。klotho蛋白與腫瘤的關(guān)系還待進一步研究。我們〔30〕在研究klotho基因多態(tài)與胃癌的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)胃癌患者395A明顯高于正常對照，這是首次關(guān)于klotho基因多態(tài)與腫瘤關(guān)系的研究。

4 展 望

Klotho是與衰老有關(guān)的新基因，目前其多態(tài)性與疾病易感性的研究主要集中在心血管、骨質(zhì)疏松和糖代謝方面的研究，而與腫瘤和免疫功能關(guān)系的研究較少。有關(guān)klotho基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系研究也應(yīng)考慮這些方面。klotho基因功能與各種老年性疾病關(guān)系的研究幫助我們闡明衰老的分子機制及內(nèi)在本質(zhì)，為更好防治衰老性疾病、延長人類壽命奠定基礎(chǔ)。

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篇3

關(guān)鍵詞：非創(chuàng)傷性股骨頭壞死；ApoA1基因-75bp/+83bp位點；中醫(yī)體質(zhì)；血瘀質(zhì)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.005

中圖分類號：R272.968.3 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）11-0017-05

Abstract： Objective To study the correlation between nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH） and ApoA1 polymorphism of blood stasis type. Methods Totally 93 cases of NONFH were selected as the case group， and 83 healthy volunteers were randomly selected as the control group. With TCM constitution questionnaire survey， the case group was screened out 32 cases of blood stasis NONFH type and 61 cases of non blood stasis NONFH type. In the case group and control group， the subjects took blood samples 2 mL， extracted DNA for PCR amplification， PCR products for DNA sequencing. G994T PAF-AH and rs9658282 gene NOS1 site polymorphism were detected for tatistical analysis. Results -75G/A gene AA ApoA1 genotype （OR： 2.578； 95%CI： 1.174-5.663； P=0.018） and A allele （OR： 1.726； 95%CI： 1.121-2.658； P=0.013） may be one of the risk factors of NONFH. Conclusion -75G/A gene ApoA1 may be related to the pathogenesis of NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of -75G/A gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH. There was no correlation between the ApoA1 gene polymorphism of +83C/T gene and the pathogenesis of blood stasis NONFH.

Key words： nontraumatic osteonecrosis of femoral head （NONFH）； ApoA1 gene-75bp/+83bp point； TCM constitutions； blood stasis

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）發(fā)病機制目前尚不完全清楚，其治療有一定的盲目性和經(jīng)驗性。對其病因分子生物學機制及藥物防治早期NONFH的研究是當今骨科研究熱點之一。中醫(yī)藥防治NONFH顯示出了一定的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在中醫(yī)辨證論治的治療原則重視對個體體質(zhì)狀態(tài)的辨析，在治療過程中發(fā)揮“因人制宜”的防治思想。本課題組前期研究顯示，血瘀質(zhì)是NONFH的高發(fā)體質(zhì)類型之一。本研究通過檢測血瘀質(zhì)NONFH患者ApoA1基因多態(tài)性，探討中醫(yī)血瘀體質(zhì)與NONFH的相關(guān)性，為通過體質(zhì)辨別運用中醫(yī)藥干預NONFH提供新的思路和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例選擇標準

NONFH診斷、納入及排除標準依據(jù)2006年中華醫(yī)學會骨科學分會關(guān)節(jié)外科學組提出的《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》[1]及《中藥新藥臨床研究指導原則》[2]制定。

1.2 中醫(yī)體質(zhì)判定標準

依據(jù)《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》[3]制訂“非創(chuàng)傷性股骨頭壞死中醫(yī)體質(zhì)類型及相關(guān)基因多態(tài)性研究”調(diào)查表，中醫(yī)體質(zhì)分為平和質(zhì)、氣虛質(zhì)、陽虛質(zhì)、陰虛質(zhì)、痰濕質(zhì)、濕熱質(zhì)、血瘀質(zhì)、氣郁質(zhì)、特稟質(zhì)9種類型。

1.3 一般資料

應(yīng)用臨床流行病學方法，于2011年1月-2013年8月在甘肅省中醫(yī)院骨科門診、住院部對NONFH患者及非血緣關(guān)系健康志愿者進行問卷調(diào)查，以NONFH患者作為病例組，無血緣關(guān)系健康志愿者為對照組。病例組93例，其中血瘀質(zhì)32例，非血瘀質(zhì)61例；對照組83例，與病例組在居住地分布上基本一致。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），體質(zhì)指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P

1.4 病例調(diào)查與樣本采集

對調(diào)查者進行相關(guān)理論知識、調(diào)查方法及實驗方法培訓。因NONFH分布不集中，故指定專職調(diào)查者進行病例的收集，并采取空腹外周血2 mL，置入裝有EDTA抗凝劑的無菌管中，混勻，-80 ℃冰箱保存。

1.5 試驗材料

TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），Premix Ex Taq Version2.0，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。引物1（10 ?mol/L）、引物2（10 ?mol/L），TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司合成。QuickCutTM MspI限制性內(nèi)切酶試劑盒，TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。滅菌蒸餾水，總醫(yī)院水處理系統(tǒng)，高壓滅菌。

1.6 試驗方法

1.6.1 DNA提取 采用TIANamp Blood DNA Kit血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）自血液中提取DNA。

1.6.2 PCR擴增 ApoA1基因-75bp/+83bp位點引物序列：上游5'-AGGGACAGAGCTGATCCTTGAACT CTTAAG-3，下游5'-TTAGGGGACACCTAGCCCTCA GGAAGAGCA-3，擴增片段長度433 bp。PCR反應(yīng)體系：Premix Ex Taq 25 ?L，上游引物（10 ?mol/L）2 ?L，下游引物（10 ?mol/L）2 ?L，模板DNA 4 ?L，滅菌三蒸水17 ?L，總體積50 ?L。將上述體系加入0.5 mL Eppendorf離心管后瞬時離心，防止體系內(nèi)液體附壁。ApoA1基因-75bp/+83bp位點的PCR反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；保存溫度4 ℃。瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳驗證，結(jié)果見圖1。

1.6.3 PCR擴增產(chǎn)物的酶切 ApoA1基因-75bp、+83bp位點的PCR擴增產(chǎn)物在快速酶切反應(yīng)體系中37 ℃溫浴30 min。①ApoA1基因-75bp位點酶切產(chǎn)物檢測：配制1.5%瓊脂糖凝膠。取5 ?L DL500 DNA Marker加入1.5%瓊脂糖凝膠第一個樣品槽中；因10×QuickCut Green Buffer中含有電泳時所必需的色素等試劑，酶切產(chǎn)物可直接進行電泳檢測，取6 ?L酶切產(chǎn)物依次按標記序號直接加樣于瓊脂糖凝膠板其他樣品槽中，電泳槽內(nèi)加入1×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。設(shè)定電壓為125 V，電流保持在80 mA以上進行電泳分離。20 min后，當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2 cm，DL500 DNA Marker條帶散開可辨時停止電泳。電泳結(jié)果使用YLNCCAP OF OLP凝膠成像系統(tǒng)進行觀察并拍照。ApoA1基因-75bp位點G被A取代，MspI酶切位點丟失，-75bp處由于堿基的變異而形成GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）和AA（179bp片段）3種等位基因型。②ApoA1基因+83bp位點酶切產(chǎn)物檢測：方法同上。ApoA1基因+83bp處C被T取代后，MspI酶切位點丟失，+83bp處的堿基變異形成CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp片段）、TT（254bp片段）或GG、GA、AA 3種等位基因型。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。首先通過χ2檢驗分析總體上各基因型及等位基因分布差異（P

2 結(jié)果

2.1 基因檢測及分型結(jié)果

176例樣品中，MspI酶切共檢測出6種基因型：GG（113bp及66bp片段）、GA（179bp、113bp及66bp片段）、AA（179bp片段）、CC（209bp及45bp片段）、CT（209bp、254bp及45bp）、TT（254bp片段）。結(jié)果見圖2。

2.2 ApoA1基因-75G/A位點多態(tài)性與血瘀質(zhì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的關(guān)系

ApoA1基因-75G/A位點病例組與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.391，P

將病例組血瘀質(zhì)、非血瘀質(zhì)與對照組兩兩比較，其中血瘀質(zhì)與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=5.434，P>0.05；χ2=2.657，P>0.05），非血瘀質(zhì)與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=5.848，P>0.05；χ2=2.377，P>0.05），血瘀質(zhì)與非血瘀質(zhì)總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.664，P>0.05；χ2=0.100，P>0.05），見表3。提示ApoA1基因-75G/A位點多態(tài)性與血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH不具有相關(guān)性。

2.3 ApoA1基因+83C/T位點多態(tài)性與血瘀質(zhì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的關(guān)系

ApoA1基因+83C/T位點病例組與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.168，P>0.05；χ2=0.650，P>0.05），見表4。提示ApoA1基因+83C/T位點基因多態(tài)性與NONFH發(fā)病無相關(guān)性。

將病例組血瘀質(zhì)、非血瘀質(zhì)與對照組兩兩比較，其中血瘀質(zhì)與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.353，P>0.05；χ2=0.345，P>0.05），非血瘀質(zhì)與對照組總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.138，P>0.05；χ2=0.504，P>0.05），血瘀質(zhì)與非血瘀質(zhì)總體上各基因型及等位基因分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.141，P>0.05；χ2=0.000，P>0.05），見表5。提示ApoA1基因+83C/T位點多態(tài)性與血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH不具有相關(guān)性。

3 討論

我們前期研究結(jié)果顯示，NONFH的病因病機以過量攝入激素類藥物及酒精中毒引起脂代謝紊亂為主[4]，脂代謝紊亂是NONFH發(fā)病的重要機制之一，血脂的異常升高可引起一系列的血管病變，如血管栓塞（脂肪滴隨血流流經(jīng)較細的股骨頭微小動脈時，形成栓塞，阻斷微循環(huán)血供）[5]、血管損傷（血液中游離脂肪酸增多造成微血管內(nèi)皮細胞功能障礙，主要包括活性氧的產(chǎn)生、凋亡的誘導以及內(nèi)皮細胞依賴性血管舒張功能的異常）[6]、血管修復功能異常（游離脂肪酸破壞血管內(nèi)皮細胞增值與凋亡的平衡，導致血管修復功能減弱），以及凝血異常（游離脂肪酸引起促凝血狀態(tài)，纖維溶解活性降低，血小板的活性和功能增強）。由此可見，脂代謝紊亂引起血脂增高是NONFH血管病變的重要因素。ApoA1作為構(gòu)成高密度脂蛋白的重要載脂蛋白，是脂質(zhì)代謝過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。如果ApoA1的結(jié)構(gòu)或表達量發(fā)生變化，則可引起血脂代謝的紊亂，導致血中脂肪酸含量異常，進一步引起上述的血管病變。ApoA1基因結(jié)構(gòu)的改變影響著ApoA1的分子結(jié)構(gòu)、生成和向血液中釋放的速率，進而影響血中ApoA1與HDL的水平。本研究選取ApoA1 -75G/A和+83C/T多態(tài)性位點，以血瘀質(zhì)NONFH患者為研究對象，并將血瘀質(zhì)NONFH、非血瘀質(zhì)NONFH及對照組進行兩兩比較，探討血瘀質(zhì)高發(fā)NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T的相關(guān)性。結(jié)果表明，AA基因型及A等位基因可能是發(fā)生NONFH的分子生物學機制之一。但并未發(fā)現(xiàn)血瘀質(zhì)NONFH與ApoA1 -75G/A和+83C/T具有相關(guān)性。

ApoA1-75G/A多態(tài)性不僅可以破壞MspI內(nèi)切酶識別位點，還能夠改變GGGCCGG序列，后者是ApoA1基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件，具有激活轉(zhuǎn)錄的作用。當該序列發(fā)生變化時，可能會影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達，從而影響ApoA1的合成。早期報道顯示，ApoA1基因啟動子-75bp A等位基因與血漿ApoA1和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）水平密切相關(guān)，并認為是A堿基的置換促進了ApoA1基因的表達及合成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，A等位基因分布頻率低可能與NONFH的發(fā)病相關(guān)。說明ApoA1表達量過低可能與本病的發(fā)生相關(guān)。如ApoA1的表達及合成減少，首先影響血漿中脂類的傳輸，其次影響激活卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT），阻礙成熟HDL的形成，從而增加肝外組織細胞及血漿中脂類的沉積，進一步使血脂升高并引起血管病變。主要可導致血管內(nèi)皮細胞凋亡，內(nèi)皮依賴性舒張功能下降并形成高凝血、低纖溶的病理狀態(tài)，脂質(zhì)過氧化形成xo-LDL沉積于血管局部，參與脂質(zhì)斑塊的形成，最終阻塞微血管，血管局部氧化性損傷及舒張性降低可阻斷微血管血流，是微循環(huán)障礙的重要因素。而這些血管病變有可能是股骨頭局部血運障礙的主要因素，這與本課題組前期研究NONFH發(fā)病的重要機制“脂代謝紊亂-血管病變”一致。本研究結(jié)果亦顯示，ApoA1-75G/A位點及A等位基因與NONFH相關(guān)。所以推斷ApoA1基因-75G/A位點A等位基因可能與NONFH發(fā)病具有相關(guān)性。也有報道顯示，ApoA1的生成率在GG純合子中顯著高于GA雜合子，同時體外觀察發(fā)現(xiàn)A等位基因伴有啟動子活性降低，并且表達水平降低[8]。本研究未發(fā)現(xiàn)GG、GA基因型與NONFH具有相關(guān)性。而A等位基因?qū)poA1表達的影響，本課題組會在后續(xù)試驗中進一步研究，并擴充樣本量，探討NONFH高發(fā)體質(zhì)類型的分子生物學機制。

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篇4

【關(guān)鍵詞】 ABCG2基因;單核苷酸多態(tài)性

AbstractABCG2 protein is one of the ATP-binding transporters expressed in human normal cells and tumor tissues，ABCG2 can inhibit the gastrointestinal absorption of which can be exogenous substances，involved in many physiological functions such as the formation of the blood-brain and placental-blood barrier. ABCG2 is a new drug efflux pump as well. It is one cause of multidrug resistance. ABCG2 gene single nucleotide polymorphism may affect the expression and function of ABCG2 protein. ABCG2 gene SNP is associated with disease susceptibility and pharmacokinetics. Single nucleotide polymorphism of ABCG2 is becoming a new hotspot. Domestic and international research on the ABCG2 gene SNP is reviewed in this paper.

Key words:ABCG2 gene;single nucleotide polymorphism

1998 年Doyle等[1]首先在乳腺癌細胞株MCF-7/AdrVp 中檢測到一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，稱為乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)，系統(tǒng)發(fā)育分析該基因為ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族(ATP-binding cassette transporter superfamily，ABC transporter superfamily)G亞家族第2成員，命名為ABCG2。ABCG2定位于細胞膜，在正常組織中分布廣泛，主要分布于具有分泌和排泄功能的組織如胎盤合體滋養(yǎng)層、小腸和結(jié)腸上皮、肝臟小管膜、膽小管膜、乳腺小葉及血管內(nèi)皮細胞中。人類ABCG2基因位于4q22～23，編碼655個氨基酸殘基。ABCG2全長66 kb，由16個外顯子和15個內(nèi)含子組成，外顯子為60～332 bp不等。ABCG2在人體內(nèi)承擔著一定的生理功能，如維持細胞穩(wěn)態(tài)、血腦屏障、胎血屏障等，同時與疾病的易感性及藥動學等相關(guān)。

單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，它是人類遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。作為“第三代DNA遺傳標記”的單核苷酸多態(tài)性標記具有位點豐富、具代表性、遺傳穩(wěn)定性和分析自動化的等特點，是研究藥物基因組學的分子基礎(chǔ)。研究單核苷酸多態(tài)性有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復雜疾病的易感性以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境因素反應(yīng)的差異。單核苷酸多態(tài)性可應(yīng)用于分子遺傳標記，分子標記診斷，在流行病學調(diào)查中的高危人群篩查，以及進行患病危險程度評價。

近年來，一些研究資料顯示，ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性可能與ABCG2的表達水平和功能有著不可忽視的作用，此外ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性與耐藥性也有著重大關(guān)聯(lián)。因此，ABCG2基因的單核苷酸多態(tài)性的研究引起了研究者的極大關(guān)注，本文從ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性的分布、對蛋白表達和功能的影響以及與腫瘤等疾病相關(guān)性的研究進展進行綜述。

1ABCG2基因的SNPs及其分布

目前已發(fā)現(xiàn)ABCG2基因有40多個SNPs，其中最為常見的3個ABCG2基因SNPs分別是C421A、G34A以及C376T。C421A是由ABCG2第5個外顯子的421位點堿基改變引起的，這個SNP導致其編碼的多肽141位谷氨酰胺變?yōu)橘嚢彼?Q141K);G34A位于ABCG2基因第2外顯子上，引起12位的纈氨酸變?yōu)榧琢虬彼?(V12M)，野生型和變異型氨基酸均不帶電荷，呈疏水性，位于ABCG2 N端細胞內(nèi)區(qū)域;ABCG2基因里的另一個單核苷酸多態(tài)是C376T(Q126stop)，造成終止密碼子代替126位的谷氨酰胺。表1為已報道的ABCG2基因編碼區(qū)SNPs。表1ABCG2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)研究者們已經(jīng)對東亞人群、高加索人群以及非洲人群的ABCG2 SNPs做了相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)ABCG2 SNPs的分布在不同人群中有顯著的差異(表2)。C421A在所檢測的人群中均可檢測得到，A等位基因的發(fā)生頻率在中國人群中高達29.0%~34.2%，日本人群為30.4%~35.5%，高加索人群為8.7%~11.9%，非洲人群中最為罕見，只有09%~53%;G34A多態(tài)性也分布于多種人群中，在瑞典人群中發(fā)生率僅為1.7%，而在越南人群中發(fā)生率高達36.0%，ABCG2基因的另一常見SNP(C376T)，僅在東亞人群可檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)生頻率為0.4%~1.9%。

2ABCG2基因SNPs對ABCG2蛋白表達及功能的影響

多項研究報道ABCG2基因單核苷酸多態(tài)性影響ABCG2蛋白的表達水平。Imai等[10]對124名日本健康志愿者的血樣作DNA分析，顯示C421A導致ABCG2表達水平下降;Furukawa等[11]用野生型和C421A重組Flp-In-293細胞研究ABCG2表達水平，結(jié)果顯示C421A表達水平約為野生型的50%，但是mRNA水平相同;Kobayashi等[8]也得出了相似的結(jié)果，并進一步證實ABCG2蛋白水平的差異由轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)而非ABCG2 mRNA水平變化所引起。Poonkuzhali等[12]研究發(fā)現(xiàn)，具有G34A單核苷酸多態(tài)性的西班牙人ABCG2 mRNA的水平明顯降低。Tamura等[13]在研究中創(chuàng)建了7個ABCG2 SNPs(V12M、Q141K、F208S、S248P、F431L、S441N、F489L)重組Flp-in-293細胞，其中F208S、S441N的表達水平下降最為明顯;Poonkuzhali等[12]對ABCG2啟動子和內(nèi)含子1單核苷酸多態(tài)性進行研究，結(jié)果顯示15622C>T攜帶者ABCG2表達水平較低，12283T>C、16702C>T與肝臟ABCG2高表達相關(guān)，1143G>A與小腸的低表達相關(guān)，15994C>T啟動子SNP顯著提高BCRP的表達水平。ABCG2基因C376T SNP雖然發(fā)生頻率較低，但由于376T等位基因不表達ABCG2，因此C376T對ABCG2功能有重要影響。

ABCG2單核苷酸多態(tài)性還可能與ABCG2蛋白的轉(zhuǎn)運活性、膜定位、底物活性等功能有關(guān)。Kondo等[14]用含有7個SNPs(V12M、Q141K、A149P、R163K、Q166E、P269S、S441N)和野生型的cDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC-PK1細胞，發(fā)現(xiàn)S441N對ABCG2蛋白的膜定位有影響，S441N表現(xiàn)為ABCG2定位于細胞內(nèi)，其余六個SNPs及野生型ABCG2均

定位于頂膜。用重組腺病毒感染HEK293細胞確定ABCG2表達水平和轉(zhuǎn)運活性，發(fā)現(xiàn)這7個SNPs對脫氫表雄酮、甲氨蝶呤、多環(huán)芳烴等轉(zhuǎn)運活性與野生無異;Tamura等[13]研究證明F208S、S441N可能會影響蛋白的穩(wěn)定性，并且F208S、S248P、F431L、S441N、F489L多態(tài)對SN-38、二羥蒽二酮、阿霉素、柔紅霉素和依托泊苷的轉(zhuǎn)運活性明顯低于野生型;Lee等[3]在韓國人群ABCG2基因多態(tài)研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶P269S多態(tài)者與野生型相比ABCG2蛋白對底物的活性下降了35%~40%，同時還證明ABCG2蛋白對底物活性下降與ATP酶抑制沒有關(guān)系;Mizuarai等[6]發(fā)現(xiàn)導入421A的SF9細胞ATP活性比野生型下降1.3倍。表2ABCG2單核苷酸多態(tài)性位點在不同人群的分布

3ABCG2基因SNPs與藥動學

ABCG2表達于胎盤、心臟、結(jié)腸、小腸、腎、肝等器官，影響著許多藥物的體內(nèi)藥動學過程。ABCG2 基因SNPs通過影響ABCG2的表達水平、底物的轉(zhuǎn)運效率、蛋白活性等，對許多藥物在體內(nèi)的藥動學發(fā)揮著作用。Urquhart等[15]在研究C421A對吉非替尼(gefitinib)的藥動學的影響中，發(fā)現(xiàn)421A多態(tài)是導致ABCG2蛋白活性減弱的原因，同時421A可能會增加藥物毒性反應(yīng)的風險，導致攜帶此多態(tài)的患者腹瀉。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，421A等位基因?qū)е翧BCG2蛋白表達下降會影響普伐他汀(pravastatin)的清除和吸收;同時還發(fā)現(xiàn)攜帶421A等位基因的中國健康男性血液中羅蘇伐他汀(rosuvastatin)濃度比ABCG2野生型高約80%。Keskitalo等[16]用32位健康人，其中5個421AA，4個421CA，23個421CC基因型，分別注射單劑量40毫克氟伐他汀(fluvastatin)，普伐他汀和辛伐他汀(simvastatin)，洗脫期為1周。結(jié)果顯示421CC、421CA基因型攜帶者血液中氟伐他汀濃度較421AA基因型攜帶者分別高出72%和97%，421CC基因型攜帶者血液辛伐他汀濃度比421AA基因型高111%，證明ABCG2基因C421A SNP顯著影響氟伐他汀和辛伐他汀內(nèi)酯的藥動學，且對普伐他汀或辛伐他汀酸有顯著影響。

ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白的底物包括一些藥物，因此ABCG2基因SNPs可能會影響攜帶人群對某些藥物的耐藥性。Cusatis等[17]體外試驗顯示421A攜帶者在細胞表面的蛋白表達降低，健康志愿者的體內(nèi)試驗結(jié)果顯示攜帶34GG/421CA的個體柳氮磺吡啶(sulfasalazine)的藥時曲線下面積(AUC)比攜帶34GG/421CC 的個體的大2.4倍，表明ABCG2單核苷酸多態(tài)影響體內(nèi)藥物處置，引起ABCG2在腸道表達的個體差異，遺傳性變異可能是藥物個體間差異的決定因素。Morisaki等[18]發(fā)現(xiàn)，421A對二羥蒽二酮(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)或SN-38耐藥性有一定降低。Imai等[10]研究表明421A細胞對二羥蒽二酮、鹽酸托泊替康比野生型敏感2~3倍，421A表現(xiàn)為低耐藥性;與前面的報道不同，De jong等[2]對84個歐洲患者血樣DNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCG2基因C421A對鹽酸伊立替康藥動學無影響。

4ABCG2基因SNPs與疾病的關(guān)系

截至目前，已有成千上萬個SNPs在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)并且被證實可以通過改變相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達和活性，從而影響人體對疾病或腫瘤的易感性，影響不同類型腫瘤的臨床生物學行為。Korenaga等[5]利用DNA探針分析法，分析200個腎細胞癌(RCC)患者和200個健康者的DNA樣本，對比患者與健康者的ABCG2基因C421A SNP，結(jié)果顯示421CC基因型在患者中頻率明顯高于健康者，表明421A等位基因是腎細胞癌的易感因素。Hahn等[19]人在前列腺癌患者中作生存分析發(fā)現(xiàn)ABCG2 421CC基因型攜帶者15個月生存率較421A等位基因攜帶者顯著降低。王瀟瀟等[20]研究了ABCG2基因的單核苷酸多態(tài)性與彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的關(guān)系，以156例DLBCL患者作為實驗組，376例健康人群作為對照組，統(tǒng)計分析BCRP基因G34A和C421A位點的SNPs分布頻率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組421位點CA、AA、CA+AA基因型頻率分別為51.3%、10.2%、61.5%;對照組CA、AA、CA+AA基因型頻率分別為43.1%、8.8%、51.9%，ABCG2基因421位點基因型CA、AA對比于野生的基因型CC，患彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的風險增加，即A為相對不良因素，這種風險在年輕的病人表現(xiàn)更顯著。此外，王瀟瀟等還發(fā)現(xiàn)ABCG2基因G34A和C421A SNPs聯(lián)合影響DLBCL的預后：G34A位點AA基因型與GG/AG基因型相比生存較差，421位點的CC基因型與較差的生存顯著相關(guān)。對比于攜帶34位點(GG+GA)421位點(AA+CA)的基因型，那些帶有34AA421CC顯示出非常差的生存。胡麗莉等[21]對ABCG2基因SNPs與彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)易感及預后的研究結(jié)果與王瀟瀟等的結(jié)果一致，同時胡麗莉等對ABCG2基因SNPs與肝細胞肝癌(HCC)的預后分析顯示攜帶ABCG2 34AA基因型的患者比攜帶G等位基因的患者總生存差，攜帶BCRP 421CC基因型的HCC患者，其死亡危險度是含有A等位基因患者的2.85倍。

Kim等[22]在預測伊馬替尼治療慢性髓性白血病效果的研究中，229個慢性髓性白血病患者基因分型結(jié)果顯示，ABCG2(G34A)GG基因型與伊馬替尼治療晚期不良反應(yīng)顯著相關(guān)。Woodward等[23]對14783人研究發(fā)現(xiàn)C421A與血尿酸水平顯著相關(guān)，421A使尿酸的轉(zhuǎn)運速率下降53.0%，從而導致血尿酸水平升高，影響痛風的發(fā)生，其中在男性中表現(xiàn)更為明顯。與上述的研究報道不同，在ABCG2基因SNPs與疾病和腫瘤關(guān)系的研究中也存在一些陰性及相反的結(jié)果：胡麗莉等[21]構(gòu)建了包括206個肝細胞肝癌(HCC)患者和265個健康人的病例—對照實驗組，用于研究ABCG2基因SNPs與肝細胞肝癌(HCC)易感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABCG2基因C421A和G34A各基因型頻率在對照組與HCC病例組差異不顯著，證明ABCG2基因C421A和G34A與HCC易感性無關(guān)。Gardner等[24]研究發(fā)現(xiàn)C421A SNP與前列腺癌的發(fā)病率無關(guān)聯(lián);但ABCG2野生型的前列腺癌生存率明顯要比攜帶421A的患者高，通過轉(zhuǎn)染HEK細胞的研究也證明421A導致PhIP轉(zhuǎn)運下降。Müller等[25]對以色列正常人群和急性骨髓性白血病(AML)患者的研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2 C421A與AML的易感性和預后均無關(guān); stergaard等[26]在克羅恩病(CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(UC)丹麥病例對照研究使用373例CD，541例UC，796例健康人結(jié)果顯示ABCG2基因SNP與CD和UC無關(guān)聯(lián)。Campa等和Andersen等的研究發(fā)現(xiàn)ABCG2 C421A與CRC的易感性無關(guān)[27-28]。

5結(jié)語

目前對ABCG2基因SNPs的研究結(jié)果出現(xiàn)了不一致的現(xiàn)象，例如大部分研究顯示ABCG2單核苷酸多態(tài)不影響mRNA的表達水平，但也有一些研究證明mRNA水平受到ABCG2單核苷酸多態(tài)性影響;在與疾病相關(guān)的研究報道中也有類似的現(xiàn)象，例如C421A與前列腺癌的生存率的兩個研究結(jié)果相反;此外一些ABCG2基因SNPs與腫瘤等疾病易感性的研究顯示，ABCG2基因的某些SNPs在不同腫瘤及疾病中發(fā)揮著不盡相同的影響。總而言之，有關(guān)ABCG2單核苷酸多態(tài)性的研究尚屬初級階段，其SNPs對ABCG2功能的影響、藥動學以及腫瘤等疾病的影響機制我們依然知之甚少。但是ABCG2單核苷酸多態(tài)性的有關(guān)研究報告已經(jīng)顯示，ABCG2單核苷酸多態(tài)性對疾病預防、診斷和患者藥物的篩選的重要性是不可忽視的。ABCG2的藥物基因組學研究剛剛起步，需要對其深入研究以了解SNPs對ABCG2功能、藥動學以及腫瘤等疾病的影響。

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篇5

[關(guān)鍵詞]雌激素α受體；雌激素β受體；慢性牙周炎

中圖分類號：R78 文獻標識碼：A 文章編號：1006-0278（2013）03-177-01

一、研究背景及方法

遺傳因素與慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，不同個體牙周健康狀態(tài)在很大程度上受遺傳基因控制。近年來，很多的關(guān)聯(lián)研究選用候選基因多態(tài)性方法，探尋基因變異與慢性牙周炎（chronicperiodontitis，CP）關(guān)系，包括抗炎細胞因子、免疫識別受體、一些骨代謝相關(guān)因子。迄今為止，牙周炎的發(fā)生發(fā)展和宿主反應(yīng)應(yīng)答機制尚未完全闡明，但可以肯定的是，慢性牙周炎非單基因影響疾病，相關(guān)基因的多態(tài)性研究為闡明慢性牙周炎易感性及骨代謝調(diào)節(jié)方面提供了有價值的工具。

二、研究結(jié)果

病例組檢出的XX、Xx、xx基因型頻率分別為22.02%、32.11%和45.87%，與對照組檢出XX、Xx、xx基因型頻率6.06%、57.58%、36.36%有顯著差異（P=0.01）。病例組與對照組的差異在女性慢性牙周炎患者組與健康對照組中更為明顯（29.82%、28.07%和42.11%與3.92%、62.75%和33.33%，P=0.01）。但是在男性病例組與對照組中未發(fā)現(xiàn)差異（P=0.08）。病例組檢出的PP、Pp、pp基因型頻率分別為27.52%、29.36%和43.12%，對照組檢出的PP、Pp、pp基因型頻率分別為27.27%、29.29%和43.43%。Pvu II基因型分布及等位基因頻率在兩組間無顯著統(tǒng)計學差異（P=0.99）。同時，性別上也未見差異P=0.83，P=0.77。病例組檢出的RR、Rr和rr基因型頻率分別為11.01%、29.36%和59.63%，在對照組分別為14.14%、39.39%和46.46%，未發(fā)現(xiàn)病例組和對照組Rsa I基因型分布及等位基因頻率有差異（P=0.16）。病例組檢出的AA、Aa和aa基因型頻率分別為4.59%、19.27%和76.15%，在對照組分別為2.02%、29.29%和68.69%。Alu I基因型分布及等位基因頻率在2組間未見明顯統(tǒng)計學差異（P=0.17）。

三、結(jié)論

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【關(guān)鍵詞】 缺血性腦卒中；基因多態(tài)性；候選基因

1 腦卒中概述

腦卒中是一種危害人類健康的常見病，在人類各種疾病死因的排序中居第二位[1]，具有高發(fā)病率高、致殘率、死亡率、復發(fā)率和并發(fā)癥多的特點。正因為如此，腦血管病的防治工作已成為當今世界醫(yī)學的重要課題。

2 腦卒中的分子遺傳學研究

缺血性卒中的發(fā)生和發(fā)展與腦血管危險因素密切關(guān)聯(lián)，所以尋找缺血性腦卒中相關(guān)致病基因成為近年研究重點。

2.1 脂類代謝相關(guān)基因多態(tài)性

2.1.1 載脂蛋白E（ApoE）基因

ApoE是血漿脂蛋白的重要組成部分之一，是脂類代謝和心腦血管疾病的決定因子。馬飛煜等[2]研究表明：ε4等位基因與I AA型腦卒中的發(fā)病相關(guān)，而與其他類型腦卒中無明顯關(guān)系。

2.1.2 載脂蛋白B（apolipoproteinB， ApoB） ApoB基因定位于2p23～24，是LDL的重要組成部分。 Aalto-Setala[3]等報道， ApoB基因C7673T突變T等位基因頻率在頸動脈粥樣硬化的腦梗死及TIA患者中較無頸動脈粥樣硬化者高，認為ApoB基因C7673T突變T等位基因與腦梗死及TIA患者動脈粥樣硬化有關(guān)。

2.2 血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）基因多態(tài)性

PAF可導致慢性血管病理損害，促進LDL的氧化修飾。張雄等[5]分析漢族人PAF-AH基因-994G/T多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)LAA 型腦卒中組TT基因型、T等位基因頻率顯著高于對照組。

2.3 5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因多態(tài)性

MTHFR是同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶，其會導致高同型半胱氨酸血癥，而高同型半胱氨酸血癥已被認為是腦血管疾病的一個獨立危險因素[6]。

2.4 炎癥反應(yīng)的相關(guān)因子的基因多態(tài)性

2.4.1 細胞介素-6（IL-6）基因

IL-6是一種炎癥細胞因子，在急性炎癥反應(yīng)的啟動中起著關(guān)鍵作用。Chmaorro A[7]等研究發(fā)現(xiàn)IL-6基因的CC基因型與較高的動脈粥樣硬化風險有關(guān)。Karahan ZC等[8]對SAA型腦梗死患者研究發(fā)現(xiàn)IL-6基因-174G/C多態(tài)性CC基因型相關(guān)。

2.4.2 IL-4基因 人IL-4基因中存在多個多態(tài)性位點。Robert等[9]報道IL-4 C590T是美國白種人血栓形成性腦梗死獨立預知因子。

2.5 腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）相關(guān)基因多態(tài)性

2.5.1 腎素基因（REN）

人類REN基因位于染色體1q32。Frossard等[10]研究得出REN基因G10631A多態(tài)性是腦卒中的危險因素。

2.5.2 血管緊張素原（AGT）基因 AGT作為RAS的唯一底物AnglI形成的限速因子，是RAS活性的一個重要決定因素。Guo ZS等[11]在對RAS基因多態(tài)與腔梗關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，AGT基因-704T/C與SAA亞型中梗死病灶的數(shù)目密切相關(guān)，是腦卒中的獨立危險因素。

2.6 一氧化氮合成酶基因多態(tài)性 一氧化氮合成酶基因家族均與動脈粥樣硬化的過程相關(guān)。迄今為止，已有大量的研究探討了NOS3基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系，但所得結(jié)論不一。

2.6.1 NOS3基因 NOS3基因定位于染色體的7q36，編碼eNOS。Elbaz等[12]研究發(fā)現(xiàn)，eNOS Glu298Asp T等位基因純合子進行研究得出-922 G>A、-786 T>C與缺血性腦卒中顯著相關(guān)。

2.6.2 NOS1基因 NOS1基因定位于染色體的12q24.2-q24.31[13]，編碼nNOS。國內(nèi)高鵬等[14]檢測605例腦梗死患者和313例對照組人群的rs9658281和rs2682820位點基因型，得出神經(jīng)元型一氧化氮合酶（NOS1）基因rs9658281位點多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病可能有關(guān)。

研究缺血性腦卒中的易感基因一方面可以讓我們從遺傳學角度篩查高危人群，進行早期預防，另一方面，基于不同亞型的易感基因不同，我們可以從遺傳學角度對缺血性腦卒中進行病因?qū)W分型，針對性進行個體治療。

參 考 文 獻

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篇7

【關(guān)鍵詞】 急性高原反應(yīng);易感性;多態(tài)性

從平原快速進入高原極易受到急性高原病的威脅，包括急性高原反應(yīng)(acute moutain sickness，AMS)，高原肺水腫和高原腦水腫，其中以AMS的發(fā)病率高，使很多人對高原有恐懼心理。近年報道未習服人員乘飛機到達3600 m左右地區(qū)的AMS的發(fā)病率為20%～50%不等，該病發(fā)病通常與到高原的速度、到高原方式，所到高度、高原的季節(jié)、個體差別密切相關(guān)[1]，提示遺傳因素在AMS的發(fā)病環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。高原缺氧是發(fā)病的主要原因，發(fā)病機理主要是[2]：(1)低氧血癥，高海拔地區(qū)空氣稀薄，大氣中氧分壓降低，肺泡內(nèi)氧分壓也降低，直接影響到肺泡氣體交換、血液載氧和氧合血紅蛋白在組織內(nèi)的釋放速度，造成供氧不足，產(chǎn)生缺氧。(2)水鈉潴留及體液重新分布，缺氧時機體對鈉、水調(diào)節(jié)能力的改變，對于機體習服高原可能起著重要作用[3]。Bartseh等報道在4559 m的重度高原病患者血漿中，醛固酮和抗利尿激素明顯升高，同時伴有尿量和尿鈉減少;而健康人則醛固酮和抗利尿激素明顯降低，尿量增加[4]，因而AMS的發(fā)生與進入高原后機體對水負荷調(diào)節(jié)能力障礙有關(guān)。AMS的常見癥狀和體征有：頭昏、頭痛、心慌、氣促、食欲減退、眩暈、鼻衄、手足發(fā)麻、手足抽搐、關(guān)節(jié)痛，多在進入高原4～5小時后開始發(fā)病，48～72小時為發(fā)病高峰，到高原2周后較少患本病，返回平原后多不治自愈。關(guān)于急性高原病的診斷，世界各地均采用癥狀評分法，其癥狀內(nèi)容均大同小異，可參考標準有《職業(yè)性高原病診斷標準GBZ92-2002》，《急性高原反應(yīng)的診斷和處理原則GJB 1098-91》和《加拿大路易斯湖標準L15S》等[5]。當LLSS評分≥3分，則該人患有AMS，如果LLSS評分

1 腎臟-血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶系統(tǒng)相關(guān)基因多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系

腎素是一種水解蛋白酶，由腎臟入球小動脈的近球細胞合成，貯存并釋放到血液中，它直接作用于肝臟所分泌的血管緊張素原，使血管緊張素原轉(zhuǎn)變成血管緊張素Ⅰ。血管緊張素Ⅰ在血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-convertion enzyme， ACE)的作用下，形成血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ具有強烈的收縮血管作用，而且可通過刺激腎上腺皮質(zhì)球狀帶，促使醛固酮分泌，潴留水鈉，引起AMS。有學者對4380 m地區(qū)的44例AMS患者和59例健康對照的尼泊爾人ACE 缺失和插入多態(tài)性研究，以及ACE 基因的 rs4291(A/T)、 rs4343(A/G)， 血管緊張素原受體基因的rs17231380 (A/C) 的SNP研究發(fā)現(xiàn)，上述基因多態(tài)性與AMS的易感性無關(guān)[7]。血管舒張素與高原習服適應(yīng)密切相關(guān)，可以有效的對抗血管緊張素的作用，在4380 m地區(qū)的100例AMS患者和相匹配的117 名健康對照的尼泊爾人中，血管舒張素基因受體基因2 (bradykinin receptor B2，BDKRB2)的rs5810761的 9bp缺失多態(tài)性和rs1799722(C/T)的SNP與AMS之間無關(guān)聯(lián)性[8]。

2 Beta-2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系

Beta-2腎上腺素能受體(beta-2 adrenergic receptor，ADRB2)是在心肌細胞分布的腎上腺素能受體亞型，主要存在于心室和心房，并在蒲肯野氏纖維和竇房結(jié)有較高的比例分布，其中在竇房結(jié)的密度比右心房高2.5倍多，這決定了ADRB2更多地參與心率和心律的調(diào)節(jié)， 可能與AMS病人中上的心率加快有關(guān)[9]。有學者通過Hapmap數(shù)據(jù)庫，選擇了ADRB2基因的7個標簽SNP：rs2400707(A/G)、rs253044 (A/G)、rs12654778 (G/A)、 rs11168070 (G/C)、rs1042713 (G/A)、 rs1042718(C/A)和rs1042719 (G/C)，發(fā)現(xiàn)在移居4380 m的103例尼泊爾(AMS病人22例，對照81例)中ADRB2的SNP與AMS的易感性無關(guān)[10]。

3 低氧感知相關(guān)基因多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系

缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factor，HIF) 和von Hippel-Lindau tumor suppressor protein (VHL) 是常見的低氧信號感知基因，可能與AMS的發(fā)病相關(guān)。Droma等對從3440 m移居到5000 m地區(qū)的104例夏爾本人(AMS病例組45例，對照組59例)的 HIF1A 基因的rs11549465位點，VHL基因 rs28940298、rs779805、 rs779808、 rs1678607、 A 1149 G的SNP分析發(fā)現(xiàn)，這些SNP與AMS的易感性不相關(guān)[11]。

4 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶M 1和T1基因多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系

在缺氧暴露的小鼠肝臟和紅細胞中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶活力明顯下降，發(fā)生AMS患者血漿中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶活力明顯下降。蔣等對谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶 (glutathione s-transferase，GST)的Ml和Tl (GSTM1/GSTT1)缺失多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系進行探討。在43例AMS病例組和相匹配的80例對照組中， AMS病例組GSTT1非缺失型基因頻率顯著高于正常對照， GSTM1缺失型頻率在AMS病例組中頻率也顯著高于對照組中的頻率，提示GSTM1、GSTT1缺失多態(tài)性與AMS有關(guān)[12]。

5 熱應(yīng)激蛋白70基因多態(tài)性與急性高原反應(yīng)的關(guān)系

從原核生物的細菌到真核生物的人類，當接觸高溫或其他應(yīng)激因素時，可以合成一組被稱為熱應(yīng)激蛋白(heat stress proteins，HSPs)的蛋白質(zhì)。HSPs最重要的功能是幫助細胞適應(yīng)一系列的應(yīng)激反應(yīng)，其多態(tài)性與疾病或機體遭受應(yīng)激的易感性或耐受性有關(guān)[13]。李芳澤等采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)的方法，通過在56例AMS患者和173例對照中探討HSP70-1和HSP70-2基因多態(tài)性與AMS的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)HSP70-1的多態(tài)性與AMS的易感性無關(guān)，HSP70-2 B/B基因型頻率顯著高于對照組，認為HSP70-2 B/B基因型與AMS易感相關(guān)[14]。

總之，近年來針對AMS發(fā)病環(huán)節(jié)，研究了一些基因的多態(tài)性與AMS易感性的關(guān)系，結(jié)果不全一致，有的相關(guān)(如GSTM1、GSTT1缺失多態(tài)性，HSP70-2 B/B基因型與AMS有關(guān))，有的不相關(guān)(ADRB2，腎臟-血管緊張素-轉(zhuǎn)換酶系統(tǒng)相關(guān)基因，低氧感知相關(guān)基因)，因而需要針對其他參與AMS發(fā)病基因展開大樣本、多中心的研究，尋找出AMS的遺傳標記，爭取早日實現(xiàn)AMS的預測，更好的服務(wù)于高原經(jīng)濟。

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篇8

[關(guān)鍵詞] 多囊卵巢綜合征 基因 CYP17 多態(tài)性

[中圖分類號] R34[文獻標識碼] A[文章編號] 1005-0515（2011）-08-025-03

Study on the Relationship Between the Polymorphisms in CYP17 Gene and Polycystic Ovary Syndrome in Jining City

Zhao ChangxingWang Fang

(Family Planning Service Stations of Jinxiang County in Jining, Jining,Shangdong,272200)

[Abstract] Objective To explore the relationship between the TC substitution of -34bp of the promotor of CYP17 gene and the pathogenesis of high testosterone homone in patients with polycystic ovary syndrome(PCOS) in Jining city.Methods 177 cases of PCOS and 159 nomal women as controls were studied in Jinxiang family planning service stations and the Affiliated Jinxiang Hospital of Jining Medical College from July 2007 to July 2010. Polymerase chain reaction and electrophoresis on polyacrylamidegel were employed to detect the TC substitution of -34bp of the promotor of CYP17 gene and its distribution.At the same time, the relationship between the mumations and high T of PCOS were compared. Results The levels of T、LH and LH/FSH were higher in PCOS group than in control group(P＜0.001);The prevalence rate of CYP17 genotype A1A1, A1A2,A2A2 and A1 and A2 in controls group respectively, Neither the genotype distributions nor the allele frequencies were statistically different between the two groups(P＞0.05);In PCOS group,the T levels of the genotype A2A2 group were statistically higher(P

[Keywords] Polycystic ovary syndrome; Gene; CYP17; Polymorphisms

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是青春期及育齡婦女最常見的內(nèi)分泌和代謝紊亂性疾病，發(fā)生率占生育婦女的4%-12%[1],其生理病理的主要特征為卵巢分泌過多的黃體生成素(LH)和睪酮(T),發(fā)病原因尚未明確，其高度的家族聚集性提示與遺傳有關(guān)。Ehrmann等[2]研究認為，17-a羥化酶/17，20-裂解酶(碼為P450c17a)調(diào)節(jié)異常是PCOS高雄激素血癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這兩種酶是卵巢雄激素合成過程中的限速酶，由CYP17基因編碼。有研究[3]表明：CYP17基因-34bp堿基置換增加PCOS的易感性和血清睪酮水平，是PCOS的致病基因之一。但是也有研究[4]認為CYP17基因的堿基置換與PCOS的發(fā)病無明顯關(guān)系，國內(nèi)這方面的研究不多。本課題對CYP17基因翻譯起點上游-34bp處的多態(tài)性與PCOS的關(guān)系進行了研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選自2007年1月至2010年1月在金鄉(xiāng)縣計劃生育服務(wù)站女性門診和濟寧醫(yī)學院附屬金鄉(xiāng)醫(yī)院不孕不育門診就診的金鄉(xiāng)及周邊各縣區(qū)(均為濟寧地區(qū))PCOS患者177例，年齡(29.98±5.10)歲，同時排除其他內(nèi)分泌紊亂所造成的高雄激素血癥。選擇同期在兩處門診因輸卵管阻塞或男方因素就診患者159例作對照組，年齡(31.74±5.88)歲，至少有一次妊娠史，月經(jīng)周期正常，無內(nèi)泌紊亂及糖尿病家族史。以體重指數(shù)[BMI=體重(kg)/身高(m)[2]≥25作為肥胖標準。

1.2 診斷標準 照美國生殖醫(yī)學年會(ASRM)鹿特丹工作組修正的診斷標準[5]，具備以下3條中的2條就可診斷為PCOS, 即：(1)無排卵或排卵不規(guī)則；(2)有雄激素水平升高的臨床(如多毛，痤瘡)或生物化學改變的依據(jù)；(3)卵巢增大，每側(cè)至少有直徑2-9mm的小卵泡12個以上；并排除產(chǎn)生高雄激素的其它內(nèi)分泌疾病，如柯興氏綜合癥，腎上腺腫瘤等。

1.3 主要儀器及試劑 Taq DNA聚合酶，dNTP，50 bp DNA、100bp DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，限制性內(nèi)切酶MspA1I購自美國Promega(普洛麥格)公司, 引物由上海博亞生物技術(shù)工程有限公司合成。PCR擴增儀由德國Eppendorf(艾本得)公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.4.1 DNA抽提 于月經(jīng)第2-3天或閉經(jīng)患者任何時期，抽取外周靜脈血5ml，取500μl全血，用EDTA抗凝，用DNA提取試劑盒按藥盒說明進行操作，無水乙醇沉淀，提取基因組DNA，自然干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 內(nèi)分泌指標檢測 所有參與者均在月經(jīng)周期的第1-3天抽取肘靜脈血，用化學發(fā)光法測定卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)水平。

1.4.3 引物設(shè)計 參照文獻[6]報道的序列設(shè)計引物。引物1：5’-CATTCGCACTCTGGAGTC-3’,引物2：5’-AGGCTCTTGGGGTACTTG -3’, 擴增CYP17基因含-34bp多態(tài)位點的一段DNA，片段大小為419bp。

1.4.4 PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系25μl，含基因組DNA0.7μl，25mmol/L Mgcl21.5μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl, 50pmol/μl引物各0.25μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)1.5μl。循環(huán)條件：94℃，預變性5min, 94℃ 1min, 66.2℃1min, 72℃1min, 35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

1.4.5 電泳分離DN斷 先經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增效果, 然后以限制性內(nèi)切酶MspA1I酶切 PCR擴增物，取酶切產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠(EB)染色，紫外投射反射儀下觀察、攝像并保存，50bpDNA Marker作參照。CYP17基因-34bp處TC的堿基置換后產(chǎn)生一個MspA1I酶的酶切位點，因此MspA1I酶切擴增產(chǎn)物后，正常無堿基置換者(A1A1)無酶切位點，仍為419bp；TC堿基置換純合子(A2A2)含一個酶切位點形成295bp和124bp 2個片段；雜合子(A1A2)形成419 bp、295bp和124bp 3個片段。

1.5 統(tǒng)計學處理 SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，用方差分析t檢驗比較組間性激素水平、BMI、年齡等，x2檢驗比較基因突變率、基因型頻率和等位基因頻率。檢驗水準：a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCOS組與對照組年齡、BMI、和基礎(chǔ)性激素水平比較 PCOS組T、LH、LH/FSH均顯著高于對照組(P＜0.01)。兩組間FSH、PRL、E2和BMI差異無統(tǒng)計學意義，PCOS組較對照組稍年輕，兩組之間年齡無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見表1

表1PCOS與對照組年齡、BMI和性激素比較（X±S）

2.2 CYP17基因經(jīng)MspA1 I酶切后的基因型和等位基因頻率分布 CYP17基因型A1A1、A1A2和A2A2頻率分布在PCOS組與對照組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。A1、A2等位基因頻率分布PCOS組與對照組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，見表2

表2PCOS組與對照組CYP17基因型和等位基因頻率比較

2.3 PCOS組和對照組CYP17各基因型間睪酮(T)水平比較 PCOS組CYP17 A2A2型T水平顯著高于A1A2型和A1A1型(P＜0.05),并且含A2等位基因組(突變組)的T水平(1.85±0.42) nmol/L顯著高于不含A2等位基因組(無突變組)的T水平(1.41±0.55)nmol/L (P＜0.05)。對照組CYP17各基因型之間的T比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。PCOS各基因型組的T值均高于對照組相應(yīng)基因型組的T值，見表3。

表3PCOS和對照組各基因型間睪酮(T)水平(nmol/L)比較

注:與A1A1組比較, P＜0.05; 與A1A2組比較, P＜0.05;a與對照組比較, P＜0.05。

3 討論 越來越多的證據(jù)證明PCOS具有一定的遺傳學基礎(chǔ),而且PCOS臨床表現(xiàn)的多樣性提示它可能有多種基因參與其發(fā)病[7]，高雄激素血癥是PCOS突出的臨床特征，參與合成類固醇激素合成的酶活性的改變可能是PCOS高雄激素形成的原因之一。

P450c17a是卵巢和腎上腺雄激素合成的限速酶,具有17a-羥化酶和17,20-裂解酶雙重活性,在雄激素的生物合成中起著重要的作用。Rosenfield等[8]用GnRH(促性腺激素釋放激素)類似物nafarelin對高雄激素血癥和PCOS婦女進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高雄激素血癥和PCOS患者腎上腺和卵巢對GnRH類似物敏感性增加，并且P450c17a酶活性增強與雄激素的過度合成和分泌有關(guān)。用ACTH(促腎上腺皮質(zhì)激素)做腎上腺刺激試驗和長效GnRH類似物triptorelin做卵巢刺激和抑制試驗，結(jié)果表明大部分高雄激素血癥的婦女卵巢和腎上腺P450c17a活性增高[9].而且，與非高雄激素血組對比，PCOS婦女卵泡膜細胞中P450c17a表達和活性增高。因此，P450c17a活性增高在PCOS高雄激素血癥的發(fā)生中起重要作用。該酶由CYP17(17a-羥化酶/17,20-裂解酶)基因編碼，CYP17基因的突變或變異將可能導致P450c17a酶活性的提高，從而增加卵巢或腎上腺雄激素的分泌。

CYP17基因位于染色體10q24.3，在其翻譯位點上游-34bp處含有一個TC堿基置換多態(tài)性位點。Dinamanti-Kandarakis等[1]對希臘50名PCOS患者和相同數(shù)量的對照婦女研究發(fā)現(xiàn), TC的堿基置換與高雄激素血癥密切相關(guān), PCOS患者A2A2基因型的血清T水平高于A1A2組和A1A2組，認為CYP17基因-34bp處TC堿基置換引起該基因的表達異常，導致P450c17a酶活性增加，進而導致PCOS高雄激素血癥的形成。Marszalek等[4]亦發(fā)現(xiàn)PCOS患者純合C等位基因表現(xiàn)為血清睪酮水平的升高。但也有研究認為CYP17基因在-34bp處TC的堿基置換與PCOS高雄激素血癥無關(guān)[10]。Gharani等[10]研究發(fā)現(xiàn), PCOS患者基因型分布與健康對照婦女無統(tǒng)計學差異, 與高雄激素血癥亦無關(guān)聯(lián)性。Kahsar-Miller 等[11]在擴大樣本后的研究結(jié)果與Gharani等[10]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，CYP17基因型A1A1、A1A2和A2A2頻率分布在PCOS組與對照組間無統(tǒng)計學差異，A1、A2等位基因頻率分布PCOS組與對照組間無統(tǒng)計學差異。PCOS患者中A2A2組T水平顯著高于A1A2和A1A1組，含A2等位基因組的T水平顯著高于不含A2等位基因組，與文獻[4]報道相符，對照組CYP17各基因型之間的T比較,差異無統(tǒng)計學意義，說明A2等位基因的存在與PCOS高雄激素血癥之間有一定的關(guān)聯(lián)性。CYP17基因5，端調(diào)節(jié)區(qū)包含4個CCACC Sp1識別位點，一般認為調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄因子識別組件的數(shù)目與該基因啟動子區(qū)域活性有關(guān)，而-34bp處TC堿基置換則產(chǎn)生一個新的Sp1識別組件(CCACTCCACC)，從而引起該區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性升高，P450c17a酶活性增高，導致雄激素合成增多，因此從分子遺傳學的角度可以揭示PCOS患者高睪酮血癥可能的發(fā)病機制之一。國內(nèi)曹云霞等[12]研究也發(fā)現(xiàn)，PCOS患者高雄激素血癥組中A2等位基因的頻率顯著高于無高雄激素血癥組，認為CYP17基因多態(tài)對于高雄激素血癥的形成有重要的輔助作用。本研究發(fā)現(xiàn)CYP17基因型分布及等位基因分布在PCOS組和對照組間無明顯差異，不同的是，國外Garey等[3]研究發(fā)現(xiàn),正常對照人群含A2等位基因的A1A2基因型分布頻率也很高,可能因CYP17基因型分布存在種族和地域差異。因此結(jié)合文獻報道，我們認為CYP17基因-34bp處的堿基置換很常見，A2等位基因可能增加P450c17a酶活性，與PCOS 高T之間有一定的相關(guān)性，可能是PCOS的重要致病基因之一。

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篇9

關(guān)鍵詞：胃癌；基因多態(tài)性；細胞色素P450；CYP2E1

胃癌是常見的惡性腫瘤之一；每年新發(fā)的胃癌患者，在全世界約為100萬，在我國約20萬[1]。人群中存在易感個體是由于一些腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因存在多態(tài)性，而針對某一個體，一個基因座位可以存在多個等位基因，且無法用突變來解釋。其中代謝酶的基因多態(tài)現(xiàn)象是腫瘤易感性的重要方面，它決定了個體對環(huán)境中致癌物的不同易感性[2]。目前在腫瘤研究中代謝酶的遺傳多態(tài)性對環(huán)境致癌物的致癌效應(yīng)的作用受到日益重視[3]，其中Ⅰ相代謝代謝有關(guān)的CYP2E1多態(tài)性與增加胃癌的發(fā)生、進展的風險有密切聯(lián)系[4]。現(xiàn)將CYP2E1基因多態(tài)性與胃癌易感性的相關(guān)性研究作一綜述。

1 CYP2E1基因概述

機體對外來化合物的代謝過程包括Ⅰ相反應(yīng)和Ⅱ相反應(yīng)，Ⅰ相反應(yīng)主要對外來化合物進行生物轉(zhuǎn)化。Ⅱ相反應(yīng)則對Ⅰ相反應(yīng)代謝活化后所產(chǎn)生的親電子中間體與體內(nèi)的化合物進行結(jié)合反應(yīng)。至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7種CYP基因的遺傳多態(tài)現(xiàn)象，它們是CYP1A1、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1。這些多態(tài)與不同部位的腫瘤危險相關(guān)。其中與胃癌發(fā)生有關(guān)的有CYP1A1、CYP2E1、CYP2C19[5]。人CYP2E1基因定位于染色體10q24.3- qter。YP2E1基因包括9個外顯子和8個內(nèi)含子，cDNA全長1497bp，由11413個堿基對組成，編碼由493個氨基酸所組成的功能蛋白質(zhì)，主要參與乙酰氨基酚、氯唑沙宗、乙醇、苯堿、亞硝胺的代謝。除在肝臟含量豐富外，近年發(fā)現(xiàn)在食道、胃、腸、腎等肝外組織有不同程度表達，活性受諸多因素影響。臨床研究發(fā)現(xiàn)， CYP1A1，CYP2E1 基因的多態(tài)性與胃癌遺傳易感性有內(nèi)在的聯(lián)系[6]。其中 CYP2E1編碼的二甲基亞硝胺 D- 脫甲基酶是參與亞硝胺及其前體物和低分子量鹵代烴類化合物在體內(nèi)代謝的主要酶類[7]。

2 CYP2E1基因致胃癌發(fā)病的機制

CYP2E1基因表達的二甲基亞硝胺D一脫甲基酶主要在肝臟表達，參與亞硝胺及其前體致癌物N一亞硝基二甲胺和N一亞硝基四吡咯烷的代謝[8]。CYP2E1主要參與亞硝胺及前致癌物的代謝，還參與黃曲霉素及四氯化碳的活化代謝，使前致癌物變成活化的終致癌物[9]。CYP2E1 基因存在 6 種限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性，分別為 Taq I、Rsa I、Dra I、Msp I、RFLP 多態(tài)以及 5' 端調(diào)控區(qū) Rsa I/Pst I 多態(tài)。其中最常見的，也是影響 CYP2EI基因表達的是 Dra I 多態(tài)和 5' 端的 Rsa I/Pst I 多態(tài)[10]。Dra I 多態(tài)是由于野生型基因（用D表示）在第6個內(nèi)含子區(qū)域存在酶切位點，而突變型基因（用C表示）在此區(qū)域第7668位點發(fā)生TA的替換點突變，Dra I 酶切位點消失[11]。因此，CYP2E1 Dra I 多態(tài)存在 3 種基因型，分別為野生基因型DD、雜合基因型CD和純合突變型CC基因型。Rsa I/Pst I 多態(tài)是位于 CYP2E1 基因 5' 端的 2個連鎖多態(tài)。Rsa I/Pst I多態(tài)存在3種基因型，分別為野生純合型A（cl/c1）、雜合型B（c1/c2）和突變純合型C（c2/c2）[12，13]。

3 CYP2E1基因多態(tài)性與胃癌關(guān)系的相關(guān)研究

CYP2E1 基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。已知大多數(shù)環(huán)境致癌物原先并不具備致癌活性，其進入人機體后需經(jīng)體內(nèi)微粒體混合功能氧化酶活化，轉(zhuǎn)變成帶有電子基團的終致癌物[14]。燕速[15]等對世居青海地區(qū)的新發(fā)胃癌的研究發(fā)現(xiàn)，CYP2E1 DraⅠ各基因型與不同分化程度的胃腺，CYP2E1基因DraI多態(tài)性位點攜帶突變基因型（C/D、D/D）者與高/高中分化胃腺癌的發(fā)生相關(guān)，是青海地區(qū)發(fā)生高/高中分化胃腺癌的危險因素；攜帶CYP2E1 DraⅠ野生純合子（C/C）者與低分化胃腺癌的發(fā)生相關(guān)，是發(fā)生低分化胃腺癌的危險因素。周濤等[16]研究表明，胃癌組 c1/c1 基因型的分布頻率高于對照組，揭示了 CYP2E1 c1/c1 基因型與胃癌遺傳易感性相關(guān)。陳元鴻等[17]研究顯示，攜帶 CYP2E1 c2/c2 基因型個體的 CYP2E1 酶活性比 c1/c1 型或 c1/c2 型攜帶者的酶活性高，攜帶 CYP2E1 c1/c2 或 c2/c2 基因型的個體比 c1/c1基因型攜帶者患胃癌風險低，進一步說 CYP2E1 c1/c1 基因型是腫瘤易感基因。王雨[18]等研究發(fā)現(xiàn)CYP2E1基因Rsa I位點等位基因c1與胃癌易感性相關(guān)聯(lián)，某些飲食因素與胃癌的發(fā)生有關(guān)。但也有研究報道 CYP2E1 基因多態(tài)性不是胃癌的危險因素[19]。究其原因，可能與CYP2E1多態(tài)性位點，在不同民族、不同地區(qū)、不同人群中的分布，以及不同學者所采用的入組標準不同等因素有關(guān)。因此，CYP2E1 多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系還需要進一步的探討。

4 問題與展望

在胃癌的發(fā)生過程中，遺傳因素與環(huán)境因素均起著不容忽視的作用。目前代謝酶基因多態(tài)性與胃癌的發(fā)生的研究處于初步階段，且研究結(jié)果不一致，有的結(jié)果還相互矛盾。主要原因可能有：①不同民族的生活習慣及環(huán)境致癌物的暴露因素不一樣，這些致癌物在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能起的作用不同；②檢測的基因多態(tài)性位點太少；③較多注重基因多態(tài)性識別，忽略了基因與環(huán)境的交互作用。因此，對于 CYP2E1 多態(tài)性的研究還需要進一步的擴大樣本數(shù)量，而且必須結(jié)合當?shù)厝朔N、民族的特點和主要病因聯(lián)合起來分析。探索 CYP2E1 多態(tài)性與腫瘤易感性之間的聯(lián)系將有助于闡明腫瘤病因及發(fā)病機制，對于腫瘤的防治尤其是腫瘤高危人群的早期篩查方面有很重要的現(xiàn)實意義。

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篇10

[關(guān)鍵詞] 抵抗素；基因多態(tài)性；2型糖尿病

[中圖分類號] R541 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）21-0048-04

人的抵抗素基因存在多種單核苷酸多態(tài)性（SNP）現(xiàn)象，而SNP與2型糖尿病間的相關(guān)性，目前并無統(tǒng)一定論，可能與研究樣本的數(shù)量、病例及位點的選取有關(guān)，更可能與不同種族間的糖尿病易感性及個體差異有關(guān)。我們研究抵抗素水平和抵抗素基因rs34861192位點多態(tài)性與T2DM的關(guān)系，分析此抵抗素基因是否為2型糖尿病的易感基因，為2型糖尿病的早期預測、診斷、治療及預后提供分子生物學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

儀器與試劑 ① 實驗儀器：質(zhì)譜檢測儀（MassARRAY Analyzer Compact），點樣儀（MassARRAY Nanodispenser），384 孔雙頭 PCR 儀（GeneAmp PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module），6mg 384純化板（SEQUENOM 公司），STAR全自動樣本工作站和FAME全自動酶標分析儀，羅氏cobase 411 全自動電化學發(fā)光免疫分析儀。 ② 主要試劑：通用基因組DNA提取試劑盒（廣州市達暉生物技術(shù)有限公司），iPLEX PCR反應(yīng)試劑盒（SEQUENOM 公司），384-well SpectroCHIP 生物芯片（SEQUENOM 公司），HOTSTART Taq酶（SEQUENOM 公司），蝦堿性磷酸酶（SAP酶，SEQUENOM 公司），陽離子交換樹脂（SEQUENOM 公司），陽性質(zhì)控YH（深圳華大基因研究院培育的“炎黃一號”細胞株DNA），抵抗素（RapidBio Lab Calabasaa），胰島素（Abbott Japan CO，LTD），葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯（中生北控生物科技股份有限公司），高密度脂蛋白膽固醇（日本第一化學藥品株式會社），低密度脂蛋白膽固醇（DiaSys Diagnostie Systems GmbH，德賽）。

1.2 對象

（1）正常對照組（CON組）：健康體檢的150例個體，無T2DM（均檢測空腹及餐后2 h血糖），無冠心?。o主述史并且心電圖無異常），體重指數(shù)（body mass index，BMI）11.1 mmol/L（200 mg/dl）；②空腹血漿葡萄糖（FPG）水平>7.0 mmol/L（126 mg/dl）；③OGTT試驗中，餐后2 h血糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）。未用過胰島素，噻唑烷二酮類及其他口服降糖藥物，并排除繼發(fā)性2型糖尿病的可能。